vendredi 19 mars 2010

Le cheminement d'une découverte... le flair et le hasard ?

Comment on a élucidé le rôle d'une protéine du virus de l'hépatite...

Récemment l'équipe du Prof. Strubin de l'Université de Genève a publié dans Nature Structural & Molecular Biology (ici) le fruit de plusieurs années de recherche. Ils étudient HBx - une des 4 protéines du virus de l'hépatite B dont le rôle n'est encore pas connu, et ils ont mis en évidence qu'elle interagit avec une protéine de la cellule infectée : DDB1- qui marque les protéines pour destruction. Les chercheurs ont montré que cette interaction se fait avec la protéine HBx pour le virus de l'hépatite comme elle se fait pour d'autres virus : celui de la rougeole entre autres.

Cette similitude ne peut être due au hasard et implique un rôle important pour cette protéine HBx. On espère avoir découvert un mécanisme crucial de l'action de ces protéines virales et peut-être un un jour un moyen de perturber ce mécanisme pour guérir.

Il est intéressant de noter que cette découverte importante est le fruit de plusieurs expériences aux résultats difficiles à comprendre voire perçus comme inutiles sur le moment.

Il s'agit de recherche fondamentale – celle qui veut améliorer la compréhension des phénomènes sans se limiter a ce qui parait immédiatement applicable. Nous verrons comment les choix fait d'intuition et de circonstances mènent à ce succès, et tenterons de mettre en perspective à travers cet exemple comment la science progresse en trébuchant sur des chemins imprévisibles.

Résumé pour les gens pressés qui veulent que ça reste simple

Etudiant une protéine virale dont on ne connaissait pas le rôle, les chercheurs effectuent diverses expériences en tâtonnant un peu. L'une d'elles ne donne pas le résultat attendu (HBx n'est pas un activateur de l'expression de gènes), mais cela rend possible une sorte de "pêche aux interactions de HBx" qui révèle qu'elle interagit avec une protéine humaine -DDB1- qui conduit à l'élimination des protéines ainsi marquées.
Il en résulte une publication de bon niveau : il est très significatif que cette interaction soit similaire à celle qu'on trouve avec d'autres virus comme celui de la rougeole. La découverte a ainsi une portée plus générale et permet d'envisager qu'on perturbe le mécanisme de plusieurs virus en perturbant cette interaction.
Mais ne nous leurrons pas, il s'agit de recherche fondamentale : son utilité ne peut pas être jugée sur la base de ses résultats immédiats, car elle prend du sens en rendant possible la recherche appliquée qui produira des médicaments ou d'autres produits dans 10 ou 20 ans... Peut-être !

En lisant avec un regard un peu décalé le cheminement qui mène à cette découverte, on voit qu'il est tout sauf linéaire, et n'était pas du tout anticipé. Il a fallu essayer de nombreuses expériences qui n'ont rien donné, être ouvert à voir le problème sous des angles nouveaux, à faire des liens inattendus avec des travaux d'autres chercheurs, rester déterminé mais patiemment ouvert. Serendipity disent les anglais, ...je ne sais pas traduire cette expression, mais ceux qui ont lu Fred Vargas retrouveront chez Adamsberg cette façon de laisser émerger les idées...
On peut aussi faire référence aux conditions de la créativité que Todd Lubart a décrites lors de la Semaine du Cerveau 2010 : notamment l'interaction entre la pensée divergente, la pensée critique et les connaissances.
On est loin de l'image d'Epinal du chercheur qui a une intuition de génie, fait une seule expérience et produit une publication qui relate une découverte révolutionnaire. On est loin aussi du schéma linéaire Observation-Hypothèses-Exprimentation-Résultats-Interprétation-

Conclusion... Ceux qui préfèrent envisager la science par ses conclusions et la biologie comme des simples connaissances à apprendre ne perdront pas leur temps à lire la suite... :-)
Pour les autres, vous saurez lire selon vos intérêts : en diagonale plus ou moins folle ou en ligne plus ou moins droite.

Dans la presse francophone


Une protéine presque au hasard

L'histoire commence avec le choix de cette HBx du virus de l'hépatite B. On la décrivait à l'époque comme capable de réguler la transcription, mais son rôle n'était pas bien connu. Le Prof. Strubin ne pensait pas travailler sur le virus à cette époque, ses recherches portent sur la régulation de l'expression des gènes en général. C'est donc un peu par hasard que HBx est étudiée. Sans doute aussi par intuition, ... D'ailleurs il est naturel dans un institut de recherche médicale d'orienter les recherches sur des virus affectant l'humain.

Que fait HBx dans la cellule humaine ?

Lorsque le virus de l'Hépatite infecte nos cellules il le fait avec seulement 4 de ses propres protéines – dont cette HBx – mais exploite comme les autres virus de nombres protéines humaines (cf Bio-Templins 30 janvier 2008 : le VIH en utilise 273). "En fait, au début on avait testé HBx, qui avait été impliquée dans le cancer, pour son activité oncogénique déjà décrite dans des cellules humaines en culture. On n'a pas trouvé cette activité. Au contraire, HBx empêchait les cellules de pousser normalement..." dit le prof Strubin. On savait aussi que la protéine virale HBx – in vitro – empêche la cellule humaine de se multiplier, sans qu'un lien clair puisse être fait avec la fonction de HBx dont le virus a besoin pour se reproduire. Enfin HBx stimule la réplication du virus. Pour le Prof Strubin c'est probablement la fonction de cette protéine virale lors de la vraie infection.
Infecter une cellule et s’y multiplier n’est pas entreprise aisée pour un virus ! En effet, l’environnement à l’intérieur de nos cellules est souvent peu propice à sa multiplication. De plus, nos cellules possèdent un système de défense efficace pour contrer l’infection. C’est pourquoi la plupart des virus produisent, en plus des composants en charge de copier l’information génétique et ceux formant la coquille du virus, des protéines dont le rôle est de modifier l’environnement cellulaire ou de bloquer le système de défense de la cellule. Le virus de l’hépatite B, bien que possédant une information génétique extrêmement limitée, n’échappe pas à cette règle Bloquer l’action des ces protéines peut constituer une approche thérapeutique nouvelle.
Prof. M.Strubin

Une exploration presque au hasard

Or l'équipe Strubin travaillait à l'époque sur la levure, et ils tentent une expérience un peu exploratoire, et son résultat négatif ouvre des perspectives... Michel Strubin dit " Cette expérience est vite faite. Et en somme assez bête. Je ne sais même plus pourquoi on a fait cela..."

Ils travaillaient sur les activateurs de la transcription. Ces derniers possèdent deux parties (domaines) : un qui lie l'ADN à une séquence bien précise et un autre qui active la transcription (Cf. figure 1) Le prof Strubin : "La grosse question était (et à mon avis est toujours...) : Que fait un domaine d'activation...". Les chercheurs les plus pointus sur la question sont bien loin des certitudes que certains ouvrages suggèrent, et que nos élèves souhaitent en général.

l'activateur est en 2 parties

Fig 1 : Un activateur est composé de deux parties : un domaine de liaison qui se fixe sur l'ADN et un domaine d'activation du gène. Associer HBx au domaine de liaison a permis de vérifier si c'était un activateur. Le signe moins ou plus signale l'activation ou non de la transcription du gène. [img]Source : Prof. Strubin

HBx était alors connue pour activer la transcription, ils ont donc voulu le tester dans la levure, un organisme que l'équipe connait bien Comme HBx n'était pas connue pour être capable de se fixer lui-même à l'ADN , ils l'ont lié a un "domaine de liaison à l'ADN" (Cf figure 1) en bas provenant d'une autre protéine pour pouvoir tester la capacité de HBx de fonctionner comme domaine d'activation. Ils ont trouvé qu'il n'activait pas la transcription.

Un résultat négatif, c'est normal, c'est le quotidien de la recherche !

Une expérience qui donne un résultat négatif c'est en fait fréquent. Un peu frustrant quand même, car ils sont en général impossibles à publier et le chercheur vit indirectement de ses publications. Le public pense souvent que le recherche est surtout faire de découvertes ....
Avec comme référence ce qu'ils ont vécu dans les laboratoires et TP qu'on fait à l'école ou à l'université : en 2x 45 minutes on conçoit une expérience, on la réalise et on obtient un résultat décisif qui est parfois présenté comme capable de prouver un concept-clé de la biologie.

En fait la recherche - encore plus en fondamentale - est bien nommée : on recherche plus qu'on ne trouve. Nous examinons ici comment de ces nombreuses expériences – qu'un regard naïf qualifierait de ratées – sort de temps en temps une découverte et parfois une très importante.

HBX réagit avec la protéine humaine DDB1

Mais le fait que HBx n'activait pas la transcription permettait d'envisager un criblage double hybride (two-hybrid screen) pour identifier des protéines de cellules humaines liant HBx. Cette technique profite de la séparation des deux domaines pour associer à chacun des protéines dont on cherche à identifer la liaison. Quand les protéines à tester se lient , l'activateur est reconstitué et le gène activé. En effet HBx exerce sans doute sa fonction lors de l'infection en interagissant avec des protéines qu'on cherche et ne trouve pas... C'est la raison de cette expérience. Ils vont alors essayer un screening (=criblage) sur un vaste assortiment de protéines (produites à partir de librairies de cDNA humain) : chaque levure reçoit un ADN avec un gène différent associé au domaine d'activation (A Cf Fig.2 ). Les colonies de levures qui poussent révèlent que la protéine de ce gène testé a interagi avec HBx, ce qui a activé le gène (HIS3) qui doit être fortement transcrit pour que la levure puisse vivre dans le milieu de l'expérience. La technique du double hybride intercale la protéine dont on veut tester les interaction entre les deux parties d'un activateur
Fig 2 : La technique du double hybride intercale la protéine dont on veut tester les interaction entre les deux parties d'un activateur : s'ils se lient le domaine d'activation active le gène. La seule association avec HBx s'est avérée être DDB1. Le signe moins ou plus signale l'activation ou non de la transcription du gène. [img]Source : Prof. Strubin


Cette expérience -là révèle une interaction de HBx avec une seule protéine humaine : DDB1 dont le rôle n'est pas très bien connu à cette époque. Son nom (Damage DNA Binding) dérive de ce qu'on pensait qu'elle participait à la réparation de l'ADN. On sait maintenant que cette protéine est impliquée dans la liaison aux protéines de l'ubiquitine – une sorte de signal de mort – qui destine les protéines auxquelles elle est fixée à être détruites. La recherche s'oriente alors sur l'interaction DDB1 HBx.

Localisation de HBx dans les cellules humaines, utilisation de la GFP

Puisque HBx est détectée aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau de la cellule, ils tentent alors une expérience pour déterminer où la protéine HBx liait son partenaire cellulaire DDB1 et exerçait ses activités de de stimulation de la multiplication virale. Ils ont associé la protéine fluorescente GFP à HBx (cf Bio-Tremplins 11Janvier 010) et l'ont exprimée dans la cellule (à partir de plasmides et par transfection). Ils ont fait s'exprimer GFP-HBx.
Quand la protéine HBx n'est pas bloquée (Gauche) ou exprimée dans le noyau seulement, la croissance des cellules est bloquée. Ligne du haut : la croissance des cellules se manifeste par des points sombres. Ligne du bas, présence de la protéine HBx associée à la GFP
Fig 3: Quand la protéine HBx n'est pas bloquée (Gauche) ou exprimée dans le noyau seulement, la croissance des cellules est bloquée. Ligne du haut : la croissance des cellules se manifeste par des points sombres. Ligne du bas, présence de la protéine HBx associée à la GFP : Fluorescence verte. Source M. Strubin CF Bio-tremplins ici

L'expérience (cf. fig.3) a montre que c'est avec HBx dans le noyau que le blocage se produit. Ce résultat est important, mais seulement dans un cercle restreint de spécialistes. On peut à ce stade dire sur HBx qu'elle facilite la multiplication du virus et qu'elle le fait en se liant a DDB1 dans le noyau de la cellule. Pour M.Strubin, sans doute la vraie fonction de HBx. Accessoirement, HBx compromet la croissance cellulaire. Mais cela pourrait être un artefact in vitro. Le virus n'est pas toxique pour les cellules.

Une collaboration internationale pour identifier cette interaction.

En parallèle commence une collaboration par e-mail avec une équipe dont il a par hasard entendu parler Ning Zheng, qui étudie par cristallographie cette interaction en 3 dimensions. Ils trouvent que l'endroit où se fait cette interaction moléculaire entre DDB1 humain et HBx viral est le même que pour une protéine appelée V d'un autre virus très différent, le SV-5 très proche du virus de la rougeole.
La protéine V du virus SV5 (Gauche) interagit avec la protéine DDB1 exactement comme HBx (droite)
Fig 4: La protéine V du virus SV5 (Gauche) interagit avec la protéine DDB1 exactement comme HBx (droite) Source Zheng et M. Strubin [img]

C'est ainsi que le Prof. Strubin de l'Université de Genève en collaboration avec un groupe de recherche américain Zheng et al. ont publié dans Nature Structural & Molecular Biology l'aboutissement de plusieurs années de recherche " A promiscuous α-helical motif anchors viral hijackers and substrate receptors to the CUL4–DDB1 ubiquitin ligase machinery"

Que fait DDB1 ?

DDB1 est une protéine qui fait partie d'un mécanisme activant une ligase E2 qui associe l'Ubiquitine à des protéines, conduisant à leur élimination par le protéasome (cf. compléments Alberts on-line )
interaction
Fig 5: L'hypothese du Pr. Strubin est que HBx sélectionne une protéine de la cellule et la guide vers la machine pour la marquer avec l'ubiquine en vue de sa degradation. La protéine DDB1 agit en marquant avec l'ubiquitine (Ub) en vue de dégradation une protéine. E2 est la ligase qui fixe Ub sur la protéine-cible. Ce que marque DDB1 avec HBx est encore inconnu. Source M. Strubin [img]

Une similitude qui en dit long ...

La similitude de l'interaction DDB1/ HBx et DDB1/ V est remarquable : similitude de la partie commune de la protéine (Un α-helical motif ) et similitude de l'endroit où elles agissent sur DDB1. Il est très significatif que ces deux protéines virales interagissent au même endroit de la même protéine DDB1 qui marque pour la destruction des protéines. D'abord cela suggère une convergence évolutive des virus : ceux des virus qui ont produit (probablement par hasard) ces protéines HBx ou V ont "marqué pour destruction" des protéines humaines permettant une meilleure reproduction du virus. Ensuite comme le virus n'a que 4 protéines on peut imaginer qu'elles soient toutes critiques pour le virus. "Il est certain qu'elles sont essentielles pour le virus ! Comme le génome est très petit, le virus aurait sans aucun doute perdu le gene HBx s'il était inutile." Donc HBx pourrait constituer une piste pour explorer plus avant les mécanismes de l'infection par ce virus chez l'humain. Enfin cela ouvre l'espoir que bloquer cette interaction aide à soigner l'infection par le virus de l'hépatite B et peut-être d'autres.

Des promesses, toujours des promesses ?

Le communiqué de presse annonce cette publication comme : "Tous différents, mais bien parents: les virus. Une étude observe la convergence des cibles choisies par le virus de l’hépatite B et celui de la rougeole [...] La mise en lumière d’une telle similitude d’attaque entre des protéines issues de familles virales fort distinctes laisse envisager de nouvelles voies thérapeutiques." Le communiqué met en évidence les espoirs thérapeutiques, et on comprend l'envie de montrer l'utilité de la recherche fondamentale en en montrant des potentiels... parfois très lointains. N'y a-t-il pas le risque que les gens, à force d'entendre ces promesses mais presque jamais informés des recherches fondamentales derrière les thérapies qui en découlent parfois des années plus tard, n'y croient plus au bout d'un moment ? Dans une époque ou la science conserve une bonne image, mais doit faire plus faire la preuve de son utilité face à des certitudes faciles de mouvements anti-science... Il vaudrait la peine de montrer aussi les effets à long terme de la recherche fondamentale.

A quoi ça sert la recherche fondamentale, si on ne trouve presque rien et quand on trouve c'est un truc tellement compliqué qu'il faut 2 pages pour comprendre à un biologiste fort de 5 années d'études ?

Cet exemple met en évidence comment la recherche fondamentale tâtonne pour mieux comprendre ce qu'on ne sait pas encore et comment des pistes infructueuses peuvent débloquer ou féconder d'autres pistes. Mais au bout de toutes ces recherches il y a des découvertes qui ont changé la recherche, la médecine et la vie quotidienne Qui aurait accordé de l'importance aux recherches de Thomas D. Brock en 1965 sur une obscure bactérie de sources chaudes Thermus aquaticus qui fonctionne à 80°C et meurt en dessous de 50°C? Pourtant c'est à ces recherches aussi qu'on doit la Taq Polymérase qui permet la PCR – sorte de photocopieuse sélective à ADN – utilisée dans quasiment tous les labos et les tests du VIH et d'autres maladies, ou pour s'assurer qu'un aliment est exempt d'OGM ... c'est finalement le prix Nobel de 1993 pour Kary Mullis.
petunias
Fig 5: Des recherches sur les pétunias ont contribué à comprendre le mécanisme de l'ARN interférant. On parlait alors de censeurs de gène. Source Wikipedia [img]

Qui aurait accordé de l'importance aux recherches presque aussi obscures sur la couleur des pétunias qui ont contribué à mettre en évidence ce qui deviendra l'ARN interférant et le prix nobel deCraig C. Mello et Andrew Z. Fire en 2006 (cf Bio-Tremplin du 30 janvier 2008) Qui aurait accordé de l'importance à des recherches sur une protéine la Green Fluorescent Protein (GFP) – peut-être pas obscure, mais qui ne s'éclaire même pas toute seule – chez une méduse... et qui mène finalement à une technique pour suivre l'expression des gènes dans les cellules vivantes très largement utilisée. (Cf Bio-Tremplin du 11 janvier 2010) Prof. Strubin note que "les trois exemples mentionnés sont devenus des outils indispensables dans la recherche."

Qui se souvient des recherches fondamentales quand une application arrive sur le marché

Le problème est qu'on gère les priorités dans notre société à court terme et que la recherche fondamentale n'est (presque) jamais utile à court terme... et une fois que les applications arrivent au grand public, les chercheurs innombrables qui ont oeuvré pour qu'une découverte majeure puisse se faire sont bien oubliés. Pourtant toute une industrie repose sur ces progrès fondamentaux et les progrès de la médecine découlent de recherches fondamentales d'il y a 10, 20 ou 30 ans... Qui se souviendra de cette recherche si jamais on arrive à avoir un traitement de l'hépatite dans de nombreuses années quand l'édifice de connaissance patiemment construit aura donné un "progrès récent de la médecine". A part nous et le prof. Strubin ?

Enseigner une science de la recherche ou de la conclusion trouvée ?

La science que les élèves rencontrent en classe et parfois à l'université n'est pas celle de ces tâtonnements et donne à voir un modèle de la science qui don ne l'impression que la science va droit aux conclusions. Evidemment selon les degrés auxquels on s'adresse, il est plus ou moins facile d'apprendre aux élèves à vivre avec les incertitudes de la science. Apprendre a vivre avec la complexité et ne pas se satisfaire de vérités simples c'est peut-être utile pour former des citoyens responsables qui pourront comprendre et voter dans un monde complexe

Liens

  • Les structures en 3D sont ici
  • ViralZone avec de très belles images du virus de l'hépatite B:
    • On peut voir sur le shéma du génome, la localisation de la protéine X
    • On peut avoir le lien vers les séquences (UniProt) de cette protéine de différentes souches de virus. Exemple iciet donc le lien pour DDB1 sur UniProtKB:
    • Lien vers le virus SV-5 @ ViralZone)
    • On trouve aussi depuis cette page, le lien vers la protéine V de différents sous-types de virus et le lien vers les structures 3D correspondantes, si elles existent....

Sources :

23 III 010 : corrections d'une image erronée et d'erreurs typographiques. 26 III 010 Lien sur un article de la Tribune de Genève

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